简并引物

■Oligo 6Oligo 6是目前使用最为广泛的一款引物设计软件，除了可以简单快捷地完成各种引物和探针的设计与分析外，还具有很多其他同类软件所不具有的高级功能：● 已知一个PCR引物的序列，搜寻和设计另一个引物的序列；●按照不同的物种对MM子的偏好性设计简并引物；● 对环型DNA片段，设计反向PCR引物；●设计多重PCR引物；●为LCR反应设计探针，以检测某个突变是否出现；●分析和评价用其他途径设计的引物是否合理；●同源序列查找，并根据同源区设计引物；●增强了的引物/探针搜寻手段。设计引物过程中，可以Lock每个参数，如Tm值范围和引物3’端的稳定性等；● 以多种形式存储结果；支持多用户，每个用户可保存自己的特殊设置。■Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0 是一种用来帮助研究人员设计最适合引物的应用软件利用它的高级引物搜索引物数据库巢式引物设计引物编辑和分析等功能可以设计出有高效扩增能力的理想引物也可以设计出用于扩增长达50kb以上的PCR产物的引物序列。该软件主要由GeneTank 序列编辑，Primer引物设计，Align 序列比较，Enzyme 酶切分析和Motif 基序分析等几个主要功能板块组成。

① 引物应在核酸系列保守区内设计并具有特异性。
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

② 产物不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

③ 引物长度一般在15~30碱基之间。

④ G+C含量在40%~60%之间。

⑤ 碱基要随机分布。
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超 过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

⑥引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

⑦引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

⑧ 引物5′端可以修饰。
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

⑨ 引物3′端不可修饰。
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。

⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。